第 19 卷第 3 期 中 国 生 物 医 学 工 程 学 报 V ol.19 N o .3
2000 年 9 月 CHIN ESE JO U RNA L OF BIOM EDICAL ENG IN EERING September 2000
AC 及 AC( Ag) 对细菌的吸附及
灭菌功能的对比研究
万怡灶 王玉林 董向红 周福刚 成国祥
(天津大学材料科学与工程学院, 天津 300072)
温廷益 韩 森
(天津中医学院第一附属医院 PCR 中心, 天津 300193) ( 天津大学化工学院一碳化工国家重点实验室, 天津 300072)
测定了活性碳( AC) 及载银活性碳( AC( A g) ) 的比表面积和孔径分布曲线, 对比研究了 AC 及 AC( A g) ) 对大肠杆菌的吸附能力和灭菌性能。 结果表明, 载银后, 虽然 AC( Ag) 的比表面积下降,但由于银的存在, 使其吸附的大肠杆菌数量高于 AC, 而吸附速率低于 AC 。 灭菌试验表明, AC 对大肠杆菌没有杀灭能力, 而 AC( A g) 对大肠杆菌有较好的灭菌功能。
关键词: 活性碳;银;大肠杆菌;灭菌性能;吸附
引言
活性碳( 以下简作-AC) 比表面积大, 吸附性能好, 与活性碳纤维相比, 其制造工艺比较成熟, 价格便宜, 因而仍是最广泛使用的工业吸附剂[ 1] 。 它可用于废水处理和净化饮用水, 作分子筛, 制作航天飞机的空气过滤器, 用于贵重金属回收等[ 1～ 3] 。此外, 由于 AC 具有非活性碳相似的结构与性能, 也具备一般碳材料的生物相容性和生物化学相容性等[ 4] , 因而也广泛应
用于医学领域, 如血液过滤等 。无论是用于净化水还是用于生物医学工程领域, AC 与细菌的生物相容性始终是一个非常重要的参数 。在生物医学工程方面, 细菌在植入材料上的粘附是导致植入材料伴生感染的主要原因之一[ 5] , 如AC 能将粘附其上的细菌杀灭, 则可避免此种感染的发生。
已有研究表明[ 6, 7] , 当活性碳纤维应用于净化饮用水时, 被吸附的细菌可在其表面生长 、繁殖, 造成对饮用水的二次污染, 为克服这一弊端, 采用了含银的活性碳纤维或表面载银的活性纤维[ 8] 。但对 AC 与细菌作用机制的研究却不多。 由于活性碳纤维与 AC 的性能有着较大的差别, 因此, 细菌能否在 AC 上粘附、生长或繁殖也值得研究。
本文以AC 及载银活性碳( 以下记为-AC(Ag) ) 为研究对象, 选择大肠杆菌为代表, 并采用
“halo”试验法[ 9] , 即抑菌环法对比研究二者对大肠杆菌的作用。 由于细菌吸附是细菌与材料作用的第一步[ 10] , 本文首先对二种材料的细菌吸附行为进行了研究。
1实验材料与方法
1.1 实验材料
本实验所用的 AC 由山西新华化工厂提供, AC( Ag) 由浸渍法获得。
收稿日期:1997-11-07, 1999-02-25 修
1 .2 菌种及其培养
1.2.1 菌种
大肠杆菌 JM 109( Escherichia coli JM 109) 。
1.2.2 培养基
固体培养基( LB 培养基) , 其组成为( g/ L) :蛋白胨 10 ;酵母提取物 5 ;氯化钠 10 ;琼脂粉 2 。
液体培养基的组成为( g/L) :蛋白胨 10 ;酵母粉 5 ;氯化钠 10 ;pH7 .4。
1.2.3 培养条件
在950m L 去离子水中加入蛋白胨、酵母提取物、氯化钠, 摇动容器直至溶质完全溶解, 用 5mol/L NaOH( 约 0 .2m L) 调 pH 值至 7 .0, 加入去离子水至总体积为 1L, 加入 2g 琼脂粉, 高压下蒸气灭菌20min, 将已灭菌的琼脂培养基冷却到 45 ℃铺平板, 然后接种大肠杆菌于固体培养基中。 将试样依次放入接种过大肠杆菌的固体培养基表面。 放入恒温箱中, 恒温( 37 ℃) 培养24h 。
1.2.4 大肠杆菌菌液的制备
将接种过大肠杆菌的液体培养基锥形瓶固定在恒温( 37 ℃) 摇床上振荡培养 24h, 经分离提纯后制成大肠杆菌悬浊液。 再用缓冲液( 18 .2g/L NaCl ;3 .1g/L Na2HPO4·12H2O ;0.2g/ L NaH2PO4·2H2O ;pH7 .4) 配制成 1010cfu/ml 的细菌溶液 。
1 .3 性能测试与表征
1.3.1 比表面积与孔径分布的测定
比表面积采用 ASAP-2400 自动物理吸附仪测定。 试样在 1 .33Pa 真空条件下于 300 ℃脱
气4h, 以高纯 N2 为载气和吸附质, 用BET 和 Langmuir 法计算并经计算机处理得到最终结果。
1.3.2 细菌吸附试验
将相同体积的不同样品放入缓冲液中浸泡, 而后依次放入小烧杯中, 将细菌悬浊液摇匀,
用消毒过的滴管依次滴注于各试样上, 每个烧杯内滴 20m L, 并使各烧杯中的菌液混匀 。 每隔 1h 各取出一块试样, 先在 20 %戊二醛液中浸泡片刻, 然后分别在 30 %、50 %和 100 %的丙酮溶液中脱水。 表面喷金处理后, 用 X-650 扫描电镜观察细菌的分布并计算单位面积( m m2) 吸附的细菌数量, 每个试样随机取 6 个视场计算细菌数量。
1.3.3 灭菌性能
灭菌试验采用“halo”试验法 。 当试样具有灭菌功能时, 将在其周围形成透明环, 即抑菌环[ 10] 。 样品的灭菌性能由抑菌环的宽度评价[ 11] 。 用普通摄相机拍摄抑菌环照片, 然后采用 JC-2 型晶粒度测量仪( ×50) 测出抑菌环的宽度。 为保证数据的准确性, 每隔 60°在不同的方向对每个抑菌环各测量 6 次, 每种试样各取 3 ～ 5 个样品进行“halo”试验, 抑菌环宽度为各样品抑菌环宽度的平均值。
2结果分析
2.1 细菌的分布特征
细菌在AC 及 AC( Ag) 表面的分布形态如图 1 所示 。可见, 大肠杆菌在 AC 表面的分布较
均匀 ;而在 AC( Ag) 表面, 大肠杆菌仅分布于银颗粒之间, 未见有细菌分布于银颗粒表面, 表现为非均匀分布的特征。
图 1 大肠杆菌在(a) AC ( b) AC( Ag) 表面的分布形态
2 .2 AC及 AC( Ag) 的孔结构特征
比表面积的测定结果显示, AC 的比表面积为 970m2/g , 而载银后比表面积下降了 39 %,
为588m2/g 。图 2 是 AC 及AC( Ag) 的孔径分布曲线 。可见, AC 具有二个极大孔分布, 一个位于2 .1nm, 另一个位于 13nm 左右;而载银后, AC( Ag) 仍具有二个极大孔分布, 一个位于 1 . 8nm, 另一个峰也位于 13nm 附近, 但不明显。 与 AC 相比, 其极值下降了 46 %。 这表明, AC 载银后, 孔径为 13nm 左右的孔大部分为银颗粒所堵塞 。
2 .3 AC与 AC( Ag) 对大肠杆菌的吸附动力学
AC 及 AC( Ag ) 细菌吸附实验的结果示于图 3 。 可见, AC 及AC(Ag) 对细菌的吸附作用差别不大, 但吸附速率有所不同。 AC 的吸附速率显著高于 AC( Ag) , AC 在吸附 1h 后, 其大肠杆菌吸附量就达到平衡吸附量的 80 %以上, 2h 后就达到吸附平衡状态 ;而 AC( Ag ) 1h 后的吸附量为 40 %左右, 2h 后还不到 70 %, 3h 后才开始趋向平衡。 此外, 二者的平衡吸附量也存在区别, AC 的平衡吸附量约为 4 .5×105cfu/mm2, 而 AC( Ag) 的平衡吸附量为 5 .3×105cfu/mm2 。
图 2 AC 及 AC( Ag) 的孔径分布曲线 图 3 细菌吸附数量与吸附时间的关系曲线
2 .4 灭菌性能
灭菌试验的结果示于图 4 。 其中图 4( b) 为 AC( Ag) 试样的抑菌环照片, 图中明显可见试样周围的抑菌环, 其平均宽度为1 .36m m, 其余为细菌正常生长的部分, 表明 AC( Ag ) 具有较强
的灭菌功能。而 AC 试样的周围未见有抑菌环( 如图 4( a) 所示) , AC 周围的细菌可正常生长。
图 4 AC( a) 及 AC( Ag) (b) 的抑菌环照片
3讨论
固体材料对细菌的吸附与材料的亲水性/疏水性 、表面电荷、表面化学成分和表面形态有关[ 12] 。 而作为吸附材料, 影响最显著的因素是比表面积 。AC 与 AC( Ag ) 相比, 其亲水性 、表面成分( 不包括 Ag ) 和表面形态相差不大, 而且, 载银过程也不改变原始 AC 的结构参数 。但 AC 表面载银后, 其比表面积大幅度下降, 从孔径分布结果看, 载银后, 孔径为 13nm 的孔多数被银颗粒所堵塞, 而正是这种尺寸的孔最适于吸附微生物[ 13] , 这似乎意味着, AC 所吸附的大肠杆菌数量应多于 AC( Ag ) ( 这种吸附可称之为物理吸附, 其吸附的细菌数量随比表面积的增大而增加) 。实测的结果并非如此, AC(Ag) 的平衡吸附量反而高于AC 。这是由于 AC( Ag ) 表面带正电, 而大肠杆菌带负电[ 5] , 因此, 除了物理吸附外, AC( Ag) 还存在对大肠杆菌的化学吸附, 这样就使其吸附的大肠杆菌数量增加, 并超过 AC 所吸附的细菌数量。 此外, 二者在吸附动力学上的差别, 说明化学吸附比物理吸附需要更长的时间才能达到平衡 。
灭菌实验结果表明, 未载银的 AC 对大肠杆菌没有杀灭能力, 只有当其表面载银以后才具备灭菌功能。银的灭菌性能与它对细胞表面或 DNA 分子的作用有关, 银离子会与细胞膜和细胞壁结合, 从而减少或终止 DNA 、RNA 和蛋白质的合成 ;银离子也可以取代 DNA 分子中的氢键而导致 DNA 分子中双螺旋结构的畸变, 最终使细菌不能存活[ 11] 。
虽然 AC 也对大肠杆菌有吸附作用, 能将大肠杆菌吸附于表面, 但因其良好的生物相容性, 被吸附在表面的细菌仍然可以正常生长, 而不会遭受破坏。 由此可知, AC(Ag) 的灭菌能力来源于银, 确切地说来源于银所释放的银离子, 这一点已为许多实验所证实[ 11, 14] 。 可以认为, AC( Ag) 的灭菌机制体现在两个方面。 首先, AC( Ag) 对细菌有吸附作用( 包括物理吸附和化学吸附) , 使得大肠杆菌与银直接接触而被杀灭 ;其次, 由于 AC( Ag) 表面的银释放银离子, 而银离子具有很强的渗透能力[ 15] , 因而可向周围扩散, 使得与银离子接触的细菌死亡 。 对 AC (Ag) 来说, 吸附数量的增加将有助于提高其灭菌功能, 而AC(Ag) 的吸附能力与银含量和原始比表面积等因素有关 。因此 AC( Ag ) 最终的灭菌功能也与银含量及AC 的原始表面积有关 。
4结论
(1) AC 载银后, 其比表面积显著下降, 孔径分布发生变化, 多数最适于吸附细菌的孔( 孔径为 13nm 左右) 被银颗粒所填塞, 使AC(Ag) 的物理吸附作用下降 。
(2) AC 及AC(Ag) 均对大肠杆菌有较强的吸附能力, AC 对大肠杆菌的吸附为物理吸附,其吸附速率较快 ;AC( Ag ) 对大肠杆菌既有物理吸附又有化学吸附, 使其平衡吸附量高于 AC 。
(3) AC 对大肠杆菌没有杀灭能力, AC( Ag) 对大肠杆菌有较强的灭菌功能。
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COMPARISON OF BACTERIAL ADSORPTION AND ANTIBACTERIAL PROPERTIES BETWEEN AC AND AC( Ag)
Wan Yizao, Wang Yulin, Dong Xianhong Zhou Fugang, Cheng Guoxiang
( College of M aterials Science and Engineering, T ianjin U niversity, Tianjin 300072)
Wen Tingyi
( PCR Center, 1st T eaching Hospital of Tianjin T raditional Chinese M edicine College, Tianjin 300193)
Han Sen
( T he State Key Laboratory fo r C1 Chemical Engineering, Colleg e of Chemical Engineering ,
Tianjin U niversity , T ianjin 300072)
BST RAC T
Specific surface area and pore diameter distribution of activated carbon ( AC ) and activated carbon supporting silver ( AC( Ag ) ) w ere determined .The bacterial adsorption capability and an-tibacterial effect against Escherichia coli of both AC and AC( Ag) were studied for comparison . Results showed that the specific surface area of AC( Ag) was smaller compared w ith that of AC due to the blockage of po res with diameter of 13nm by silver particles .The bacterial number ad-sorbed by AC( Ag) w as g reater by comparison to AC, but bacterial adso rptio n rate of AC( Ag ) w as slow er than that of AC .Antibacterial tests indicated that AC demonstrated no antibacterial effect, AC(Ag) , how ever, exhibited strong antibacterial property .
Key words: A ctiv ated carbon ;Silver ;Escherichia coli ;Antibacterial property ;Adsorption
